Ja eksperiments neizdodas, vai esat kādreiz rādījis ar pirkstu uz dārgiem reaģentiem vai sarežģītiem instrumentiem? Bet dažreiz īstais "vaininieks" var mierīgi paslēpties stūrī - šķietami parastā bufera reaģenta pudele. Lai gan tas ir neuzkrītošs, tas ir glābšanas riņķis, lai saglabātu eksperimenta precizitāti. Šodien mēs atklāsim šī "neredzamā aizbildņa" noslēpumu.
Ⅰ. Buferis: kas tas ir? Kāpēc tas ir neaizstājams laboratorijā?
Vienkārši sakot, buferis ir īpaša šķīduma sistēma, kas var izturēt neliela daudzuma pievienotas skābes, sārma vai atšķaidīšanas ietekmi un uzturēt relatīvi stabilu šķīduma pH vērtību. To parasti veido pāris "partneru" - vāja skābe un tās konjugētā bāze (vai vāja bāze un tās konjugētā skābe), piemēram, etiķskābe/nātrija acetāts (HAc/Ac-), nātrija dihidrogēnfosfāts/nātrija hidrogēnfosfāts (NaHPO₂₄PO), kas ir bieži sastopami. laboratorijas.
Galvenā spēja: stabilizēt pH līmeni un pretoties izmaiņām!
Ja eksperimentā nejauši tiek ievadīts neliels daudzums skābu vai sārmainu vielu, bufera "partneris" ātri reaģēs kā efektīvs "ūdeņraža jonu sargs", absorbējot vai atbrīvojot to, tādējādi izvairoties no krasām šķīduma pH svārstībām. Šī spēja ir būtiska daudzām bioķīmiskām reakcijām, kuru pamatā ir noteikta pH vide.
Ⅱ. Laboratorijas posms: neaizstājams galvenais varonis un atbalsta loma
1. Bioķīmisko eksperimentu "dzīvības atbalsta sistēma":
Fermentu aktivitātes pētījumi:Lielākajai daļai enzīmu ir optimāla aktivitāte tikai šaurā pH diapazonā. Buferi (piemēram, Tris-HCl, PBS) nodrošina stabilu "darbgaldu" fermentu reakcijām, lai nodrošinātu ticamus rezultātus.
Olbaltumvielu attīrīšana un analīze:Sākot no šūnu līzes, hromatogrāfiskas atdalīšanas (jonu apmaiņa, afinitātes hromatogrāfija) līdz elektroforēzei (piemēram, SDS-PAGE), olbaltumvielu kristalizācijai un uzglabāšanai, katrā posmā ir nepieciešams buferšķīdums ar noteiktu pH, lai saglabātu proteīna struktūru, lādiņu un šķīdību un novērstu denaturāciju vai nogulsnēšanos.
Nukleīnskābju manipulācijas:PCR reakcija, DNS/RNS ekstrakcija, fermentu gremošana, ligēšana, hibridizācija un citi procesi ir ārkārtīgi jutīgi pret pH. Parasti izmantotie buferi, piemēram, TE (Tris-EDTA), var stabilizēt nukleīnskābju struktūru un aizsargāt tās no nukleāzes noārdīšanās.
2. Šūnu kultūras "šūpuļdziesma":Šūnu barotne (piemēram, DMEM, RPMI) pati par sevi ir sarežģīta bufersistēma (bieži paļaujas uz nātrija bikarbonāta/oglekļa dioksīda sistēmu). Papildu buferu (piemēram, HEPES) pievienošana var nodrošināt šūnām stabilāku pH vidi, īpaši mainot šķidrumus, novērojot vai ja oglekļa dioksīda koncentrācija var svārstīties, lai nodrošinātu veselīgu šūnu augšanu.
3. Analītiskās ķīmijas "stabilizējošais spēks":
Hromatogrāfiskā atdalīšana:Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijā (HPLC) un jonu hromatogrāfijā (IC) mobilās fāzes pH ir galvenais atdalīšanas efekta kontroles parametrs, un buferi (piemēram, fosfāti un acetāti) nodrošina atdalīšanas procesa atkārtojamību.
Titrēšanas analīze:Dažas titrēšanas reakcijas ir jāveic pie nemainīga pH vai jānorāda beigu punkts, kad tiek sasniegts konkrēts pH, un buferšķīdumam ir stabilizējoša loma.
Standarta šķīdumu sagatavošana:Daudzu standarta šķīdumu pH vērtība ir precīzi jākontrolē, un pamatā ir buferšķīdumi.
Ⅲ. Izvēle un izmantošana: daudz zināšanu
Izvēlieties pareizo bufera sistēmu:
pKa vērtība ir galvenā:Bufera efektīvās buferizācijas diapazons parasti ir tā pKa ± 1 vērtības diapazonā. Noteikti izvēlieties buferšķīdumu, kura pKa vērtība ir tuvu nepieciešamajam darba pH līmenim! Piemēram, fosfātu (pKa ~ 7,2) bieži izmanto neitrālā pH diapazonā, un Tris (pKa ~ 8,1) bieži izmanto sārmainā.
Saderība:Apsveriet, vai bufera komponenti neietekmē jūsu eksperimentālo reakciju (piemēram, fosfāts var traucēt dažiem fosforilēšanas pētījumiem, un borāts var reaģēt ar cukuriem).
Jonu stiprums un temperatūra:Jonu stiprums ietekmē fermentu aktivitāti, šķīdību utt.; temperatūras izmaiņas var būtiski ietekmēt tādu buferu kā Tris pKa vērtību (Tris ir liels pKa temperatūras koeficients aptuveni -0,031/grādi).
Ⅳ. Kopējo buferu saraksts
1. PBS bufera sērija
PBS buferis 1× (pH7.4), PBS buferis 10× (pH7.4), PBS fosfāta pulveris (bez kalcija un magnija joniem): šūnu mazgāšana šūnu kultūras eksperimentos (piemēram, pirms barotnes maiņas); antivielu atšķaidīšana un ELISA plākšņu mazgāšana imunoloģijas eksperimentos; osmotiskā spiediena un pH stabilitātes uzturēšana proteīnu/nukleīnskābju eksperimentos utt.
DPBS buferšķīdums (bez kalcija un magnija), DPBS fosfāta pulveris (bez kalcija un magnija joniem): plūsmas citometrija šūnu eksperimentos, mazgāšana pēc šūnu sagremošanas (lai kalcijs un magnijs netraucētu fermentu aktivitāti); enzīmu atšķaidīšana vai jonu-jutīgu eksperimentu veikšana molekulārajā bioloģijā (piemēram, noteiktas PCR reakcijas) utt.
PBST buferis (1×), PBST buferis (10×): izmanto Western Blot vai imūnhistoķīmijas soļu bloķēšanai un mazgāšanai, nespecifiskās saistīšanās samazināšanai utt.
2. TBS bufera sērija
TBS buferis (1×), TBS buferis (10×): imunoloģiskajos eksperimentos aizstāt PBS buferi (lai izvairītos no fosfātu traucējumiem ar noteiktu antivielu saistīšanos); stabilizēt sārmainu pH vidi proteīnu eksperimentos utt.
3. HBSS bufera sērija
HBSS buferis (bez kalcija un magnija, bez fenola sarkanā)/Henka buferšķīdums (bez kalcija un magnija): šūnu atdalīšana un centrbēdzes mazgāšana šūnu eksperimentos (piemēram, plūsmas citometrija); īstermiņa-šūnu uzturēšana (piemēram, dzīvu šūnu attēlveidošana) utt. HBSS buferis (nesatur kalciju un magniju, nesatur fenola sarkano): uztur šūnu vielmaiņas aktivitāti šūnu kultūrā (kalcijs un magnijs piedalās signāla transdukcijā); šūnu migrācijas/invāzijas eksperimenti.
4. TE bufera sērija
TE buferis (1×), TE buferšķīdums (10×): izšķīdina un uzglabā DNS/RNS (Tris uztur pH, EDTA helātus veido metālu jonus, lai inhibētu nukleāzes aktivitāti); atšķaidītu DNS PCR, sekvencēšanai un citiem eksperimentiem.
5. Elektroforēzes bufera sērijas
TAE buferis (1×): parastā DNS agarozes gēla elektroforēze (zema izšķirtspēja, piemērota lieliem DNS fragmentiem). TBE buferis (1×), TBE buferis (10×): augstas-izšķirtspējas DNS/RNS elektroforēze (piemēram, mazu fragmentu vai poliakrilamīda gēla elektroforēze); ilgtermiņa elektroforēze (buferizācijas jauda ir labāka nekā TAE).
6. Western Blot eksperimentu buferu sērija
Western Blot pārneses buferis (10×): buferis, ko izmanto proteīnu pārnešanai no gēla uz membrānu (piemēram, PVDF membrānu), kas satur Tris, glicīnu un metanolu.
Tris-HCl buferšķīdums (1 mol/L, pH 6,8): SDS-PAGE koncentrēta gela sagatavošana utt.
Tris-HCl buferšķīdums (1,5 mol/L, pH 8,8): SDS-PAGE separācijas gēla sagatavošana utt.
7. Standarta pH bufera sērija
pH=4.00/6,86/9,18 buferšķīdums (sagatavots 250 ml): standarta šķīdums pH metra kalibrēšanai (piem., pH 6,86 ir neitrāls standarts, pH 4,00 un 9,18 ir skābie un sārmainie standarti).
Buferreaģenti nekādā gadījumā nav pamata palīgfunkcija laboratorijā. To galvenā vērtība ir nodrošināt precīzu un stabilu protonu vidi, kas ir stūrakmens termodinamiskā līdzsvara un vairuma bioķīmisko reakciju kinētiskā ātruma uzturēšanai. No enzīmu aktīvo vietu mikrovides regulēšanas līdz biomakromolekulu konformācijas stabilitātes garantēšanai un transmembrānu jonu gradientu uzturēšanai, bufersistēmas pH buferspēja ir neaizstājams priekšnoteikums eksperimentālo datu atkārtojamībai un ticamībai. Bīkmens jūs pavadīs jūsu zinātniskās izpētes ceļojumā.
Hunan BKMAM Holding Co., Ltd
Vietne: www.bkmbio.com
E-pasts:info@bkmbio.com